壶腹癌中P16蛋白及PCNA表达的临床意义

p16基因是一个参与调控细胞周期的抑癌基因，当发生突变或缺失后可促使细胞无限制地生长，对肿瘤的发生、发展有着重要的作用。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种仅出现在增殖状态细胞核内的酸性蛋白质，是反映肿瘤细胞DNA合成情况和增殖活性的重要指标，可用于判断肿瘤细胞的增殖状况。我们应用免疫组织化学ABC法，检测P16蛋白及PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中的表达，结合临床资料，评价其在壶腹癌中表达的意义。

 

1材料和方法

 

1.1研究对象本组45例，男31例，女14例，年龄36～78岁，平均(54±9)岁，为本院普通外科1996年1月至1999年1月间收治患者，均行胰十二指肠切除术，术后病理证实为壶腹癌。病理组织学类型：管状腺癌33例、乳头状腺癌12例。肿瘤分化程度：高分化11例、中分化20例、低分化14例。淋巴结转移：阳性25例、阴性20例。已穿透十二指肠浆膜、侵犯胰头24例。肿瘤直径2 cm以上25例，小于或等于2 cm 20例，按UICC的TNM分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例。

 

1.2试剂PCNA(PC10)单克隆抗体为美国Sigma公司产品，兔抗人P16抑癌基因多克隆抗体和ABC试剂盒均为武汉博士德公司产品。

 

1.3方法(1)肿瘤标本经10%甲醛固定、取材、石蜡包埋保存。每例蜡块连续切片3张，厚5μm，备染，另取距肿瘤2 cm处正常胰腺组织作对照。其中一张作苏木精-伊红(HE)染色，另两张脱蜡后免疫组织化学ABC染色，按试剂盒说明书进行。以已知胃癌阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。作ABC染色前，均对抗原用常规方法进行微波修复处理。(2)结果判断：P16蛋白定位于胞浆内，染成浅黄色或棕黄色颗粒状为阳性；PCNA阳性表达定位于细胞核，呈颗粒状或弥散散在；PCNA表达占肿瘤细胞的25%以下为“阴性”，大于25%记为“阳性”。

 

1.4统计学处理采用χ2检验、等级相关分析。 

 

2结果

 

2.1 P16蛋白及PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中的表达P16蛋白在壶腹癌中的阳性表达率为40.0%(18/45)，为胞浆表达，阳性细胞以局灶状分布为主；在癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率为81.8%(9/11)，两组阳性表达具有显著性差异(P＜0.05)。PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中阳性表达率分别为64.4%(29/45)及54.5%(6/11)，为胞核着色，壶腹癌组织中阳性肿瘤细胞呈片状分布，核多为不规则形，正常胰腺组织呈散在分布，两组间阳性表达无显著性差异。

 

2.2壶腹癌P16蛋白及PCNA表达与临床病理特征的关系P16蛋白在壶腹癌中阳性表达率为40.0%(18/45)；PCNA阳性表达率为64.4%(29/45)。P16蛋白阳性表达随肿瘤细胞分化程度的降低而降低，在高分化、中分化、低分化中的阳性表达率分别为63.7%，45.5%及14.2%，高分化与中分化、低分化比较有显著性差异(P＜0.05)；PCNA表达阳性率随肿瘤细胞分化程度降低而升高，在高分化、中分化、低分化中分别为45.5%，65%及78.6%，但各级间无显著性差异。在有胰头侵犯、淋巴结转移、肿瘤直径＞2 cm者，P16表达显著下降（P＜0.05），PCNA的表达阳性率在有淋巴结转移者明显上升（P＜0.05），与有无胰头侵犯、肿瘤直径大小无关。

 

2.3壶腹癌P16蛋白及PCNA表达与临床分期的关系P16蛋白表达随壶腹癌临床分期升高而降低，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中的阳性表达率依次为58.8%，38.5%及20.0%，低分期组(Ⅰ、Ⅱ期)与高分期组(Ⅲ期)比较阳性表达率有显著性差异(P＜0.05)；PCNA在各期表达无明显规律，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期阳性率分别为52.9%，69.2%，及73.3%。

 

2.4壶腹癌P16蛋白表达与PCNA表达间相互关系18例P16表达阳性患者中，8例PCNA表达阳性，10例阴性；27例p16表达阴性患者中，21例PCNA表达阳性，6例阴性。统计结果表明，P16蛋白表达与PCNA表达呈明显负相关(r=-0.57，P＜0.05)。

 

3讨论

 

p16抑癌基因定位于人9号染色体短臂2区1带(9P21)，其染色体组有3个外显子，表达产物为P16蛋白，P16蛋白通过抑制细胞周期素依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）活性参与并调节细胞从G0期进入G1期，若没有P16蛋白的抑制作用，细胞会异常增生，发生癌变［1，2］。我们的研究提示，P16在壶腹癌中的阳性表达率随细胞分化程度降低、肿瘤分期的升高而下降，癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率显著高于癌组织中的表达率，提示p16基因在壶腹癌的发生发展中起重要作用；P16在分化程度低、有淋巴结转移、胰头侵犯、肿瘤直径超过2 cm者表达明显降低，说明P16表达缺失与壶腹癌恶性程度、转移有关，提示p16基因检测可作为判断壶腹癌恶性程度的标志［3］。

 

PCNA是一种核蛋白，能与DNA多聚酶σ结合，与DNA复制有关，其阳性程度可直接反映DNA复制的活跃程度，可作为研究细胞增殖状态的一项指标［4，5］。本研究结果显示，PCNA的阳性表达率随肿瘤的分化程度降低而上升，在有淋巴结转移者明显升高，提示PCNA可作为肿瘤细胞恶性增殖的指标。P16的表达与PCNA呈显著的负相关，其机制尚不完全清楚，可能是p16基因失活，导致其与细胞周期素竞争抑制CDK4活性作用消失的结果。我们认为，联合检测P16和PCNA对判断壶腹癌的恶性程度有指导意义。